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转录组分析是一种用于研究细胞或组织中所有RNA分子的表达水平的高通量技术。完成转录组分析后#xff0c;科学家们通常需要通过定量实时聚合酶链式反应#xff08;qRT-PCR#xff09;来验证二代测序#xff08;Next-Generation Sequencing, NGS#xff09;结果的可靠…介绍
转录组分析是一种用于研究细胞或组织中所有RNA分子的表达水平的高通量技术。完成转录组分析后科学家们通常需要通过定量实时聚合酶链式反应qRT-PCR来验证二代测序Next-Generation Sequencing, NGS结果的可靠性。这是因为qRT-PCR是一种精确的定量方法可以用来验证特定基因的表达水平。
荧光定量PCRQuantitative Real-Time PCR是一种利用荧光信号来实时监测PCR扩增过程的技术。它允许研究者在PCR反应进行时实时检测DNA的累积量从而实现对基因表达水平的定量分析。
在进行相对定量分析时常用的方法之一是双标曲线法也称为标准曲线法或绝对定量法。这种方法的基本步骤如下
标准曲线的构建首先需要通过一系列已知浓度的标准品通常是目标基因的克隆DNA进行PCR扩增以获得一系列的Ct值阈值循环数即PCR扩增过程中荧光信号首次超过阈值的循环次数。然后将这些Ct值对数转换后与相应的DNA浓度绘制成图形成标准曲线。样本的Ct值测定接下来对实验样本进行qRT-PCR记录目标基因的Ct值。相对定量计算利用标准曲线根据样本的Ct值计算出样本中目标基因的相对浓度。这通常涉及到将样本的Ct值转换为DNA浓度然后与标准品的浓度进行比较。数据归一化由于qRT-PCR可能会受到实验操作和样本制备的影响因此需要使用一个或多个内参基因通常是表达水平相对稳定的基因来归一化数据以消除这些潜在的变异。结果表达最终研究者会以目标基因相对于内参基因的表达水平来表达结果通常是以2的幂次方来表示倍数变化。
通过这种方法研究者可以验证NGS结果的准确性并进一步探索基因表达的调控机制。ΔCt法2-ΔΔCt法(Livak法)用参照基因的2-ΔΔCt法(Livak法): qRT-PCR介绍及计算公式
该部分引用自下方参考链接1
qRT-PCR原理
以基因的cDNA为模板进行PCR扩增在PCR扩增过程中通过收集荧光信号对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系所以可以定量。
Ct值
Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 (cycle)。 qRT-PCR在扩增的时候都会有平台期在平台期之前PCR 扩增就是简单的指数增长也就是 1 变 22 变 44 变 8 …扩增。数学形式就是 2 的 ct 次方到了平台期所有基因扩增的数目是一致的而唯一有区别的则是 ct 值的不同。所以不难推断出 ct 值越小反应扩增到达平台期所需循环数越少目的基因起始含量越高。这里可以得到公式
计算 -ΔΔCt内参基因分为对照组和处理组内参基因 先计算对照组和处理组的内参基因Ct的均值 M e a n 内参基因 m e a n ( 对照组或处理组内参基因 ) Mean_{内参基因}mean(对照组或处理组内参基因) Mean内参基因mean(对照组或处理组内参基因) 计算对照组待检测目的基因减去对照组内参基因的平均Ct值 Δ C t 对照组目的基因 i C t 对照组目的基因 i − C t 对照组内参基因的平均值 ΔCt_{对照组目的基因i} Ct_{对照组目的基因i} - Ct_{对照组内参基因的平均值} ΔCt对照组目的基因iCt对照组目的基因i−Ct对照组内参基因的平均值 计算处理组待检测目的基因减去处理组内参基因的平均Ct值 Δ C t 处理组目的基因 i C t 处理组目的基因 i − C t 处理组内参基因的平均值 ΔCt_{处理组目的基因i} Ct_{处理组目的基因i} - Ct_{处理组内参基因的平均值} ΔCt处理组目的基因iCt处理组目的基因i−Ct处理组内参基因的平均值 计算基于对照组的-ΔΔCt处理组待检测目的基因的ΔCt减去对照组待检测基因的ΔCt的平均值 − Δ Δ C t 处理组目的基因 i Δ C t 处理组目的基因 i − Δ C t 对照组目的基因 i 的平均值 -ΔΔCt_{处理组目的基因i} ΔCt_{处理组目的基因i} - ΔCt_{对照组目的基因i的平均值} −ΔΔCt处理组目的基因iΔCt处理组目的基因i−ΔCt对照组目的基因i的平均值 相对表达量计算也就是相对于对照组: 2^-ΔΔct: 2 − ( − Δ Δ C t ) 2^{-(-ΔΔCt)} 2−(−ΔΔCt) 条形图或相关性点图可视化结果
R代码
加载R包
knitr::opts_chunk$set(warning F, message F)
library(dplyr)
library(tibble)
library(ggplot2)
library(xlsx)
library(Rmisc)R函数
get_qPCR - function(datasetdat,ref_geneGAPDH,control_group6H NC,grpc(6H M1)){# datasetdat # 初始数据# ref_geneGAPDH # 内参基因名字# control_group6H NC # 对照组# grpc(6H M1) # 实验组排序if(!any(is.element(colnames(dataset), c(Sample_Name, Target_Name, CT)))){stop(Check the sheets colnames)}sampleid - c(Sample_Name, Target_Name, CT)dat - dataset %% select(sampleid)# step1: 计算对照组和处理组的内参基因平均值dat_ref_gene - dat %% filter(Target_Name ref_gene) ref_gene_mean - dat_ref_gene %% group_by(Sample_Name) %%dplyr::summarise(CT_ref_mean mean(CT))# step2: 计算对照组和处理组待检测目的基因减去对应分组的内参基因的平均Ct值dat_gene - dat %% filter(Target_Name ! ref_gene) dat_gene_merge - dat_gene %% inner_join(ref_gene_mean, by Sample_Name)dat_gene_merge$CT_delta - with(dat_gene_merge, CT - CT_ref_mean) dat_control - dat_gene_merge %% filter(Sample_Name control_group) %%group_by(Sample_Name, Target_Name) %%dplyr::summarise(Delta_CT_control_meanmean(CT_delta)) %% dplyr::rename(Sample_Name_controlSample_Name)dat_treat - dat_gene_merge %% filter(Sample_Name ! control_group) %%# group_by(Sample_Name, Target_Name) %%# dplyr::summarise(Delta_CT_treat_meanmean(CT_delta)) %% dplyr::rename(Sample_Name_treatSample_Name)# step3: 计算对照组检测基因的平均Δ值dat_double_delta - inner_join(dat_treat, dat_control,by Target_Name)dat_double_delta$CT_delta_delta - with(dat_double_delta, CT_delta - Delta_CT_control_mean)# step4: 基于对照组检测基因的平均Δ值计算实验组的2-ΔΔCt值dat_double_delta$qPCR - 2^-(dat_double_delta$CT_delta_delta) # step5: 条形图或相关性散点图可视化dat_plot - dat_double_delta %% dplyr::rename(Sample_NameSample_Name_treat) %%dplyr::select(Sample_Name, Target_Name, qPCR) dat_plot_bar - Rmisc::summarySE(dat_plot, measurevar qPCR, groupvars c(Sample_Name, Target_Name)) %%mutate(Sample_Namefactor(Sample_Name, levels grp),Target_Namefactor(Target_Name)) %% group_by(Sample_Name, Target_Name) %%mutate(ylimit(qPCRsd)) %%ungroup()dat_plot_bar_ymax - dat_plot_bar %% group_by(Target_Name) %% summarise_at(vars(ylimit), max)# dat_plot_range - dat_plot %% group_by(Sample_Name, Target_Name) %%# summarise(yminmin(qPCR), ymaxmax(qPCR))# setting y axis scaley_group - c()y_scale - c()for(i in 1:nrow(dat_plot_bar_ymax)){y_group - c(y_group, rep(as.character(dat_plot_bar_ymax$Target_Name[i]), 2))y_scale - c(y_scale, c(0, ceiling(dat_plot_bar_ymax$ylimit[i])))}blank_data - data.frame(Target_Name y_group, Sample_Name 1, qPCR y_scale)# step6: visualizationpl - ggplot(dat_plot_bar, aes(xSample_Name, weightqPCR))geom_hline(aes(yintercept qPCR), color gray)geom_bar(color black, width .4, position dodge)geom_errorbar(aes(ymin qPCR, ymax qPCR se), width 0.25, size 0.5, position position_dodge(0.7))labs(x, yexpression(paste(log[2], fold change in expression))) geom_blank(data blank_data, aes(x Sample_Name, y qPCR))expand_limits(y 0)scale_y_continuous(expand c(0, 0))facet_wrap(. ~ Target_Name, scales free)theme_bw()theme(axis.title element_text(face bold, color black, size 14),axis.text element_text(color black, size 10),axis.text.x element_text(angle 60, hjust 1, face bold),text element_text(size 10, color black, familyserif),panel.grid element_blank(),legend.position right,legend.key.height unit(0.6, cm),legend.text element_text(face bold, color black, size 10),strip.text element_text(face bold, size 14))res - list(datdat_double_delta, plotpl)return(res)
}读取数据
单个样本三个技术重复检验不同的目的基因扩增效率。数据下载链接
百度云盘链接: https://pan.baidu.com/s/1W4Uvoy3Z7i9s8dWGOOkKWw 提取码: vh4s
dat - read.xlsx(qPCR.xlsx, sheetIndex 1)
head(dat)计算结果
qPCR_res - get_qPCR(datasetdat,ref_geneGAPDH,control_group6H NC,grpc(6H M1))
DT::datatable(qPCR_res$dat)可视化结果
qPCR_res$plot结果 IL-1B 和INOS基因相比NC组而言其含量越多 参考 qRT-PCR相对定量计算详解 geom_lines in different facet 文章转载自： http://www.morning.fhqsm.cn.gov.cn.fhqsm.cn http://www.morning.dfltx.cn.gov.cn.dfltx.cn http://www.morning.nqwkn.cn.gov.cn.nqwkn.cn http://www.morning.fwkjp.cn.gov.cn.fwkjp.cn http://www.morning.xwnnp.cn.gov.cn.xwnnp.cn http://www.morning.pnmgr.cn.gov.cn.pnmgr.cn http://www.morning.jqhrk.cn.gov.cn.jqhrk.cn http://www.morning.tqbyw.cn.gov.cn.tqbyw.cn http://www.morning.dfffm.cn.gov.cn.dfffm.cn http://www.morning.xgbq.cn.gov.cn.xgbq.cn http://www.morning.jrgxx.cn.gov.cn.jrgxx.cn http://www.morning.xhlht.cn.gov.cn.xhlht.cn http://www.morning.xiaobaixinyong.cn.gov.cn.xiaobaixinyong.cn http://www.morning.thrtt.cn.gov.cn.thrtt.cn http://www.morning.qbzdj.cn.gov.cn.qbzdj.cn http://www.morning.bnlkc.cn.gov.cn.bnlkc.cn http://www.morning.bqfpm.cn.gov.cn.bqfpm.cn http://www.morning.gkpgj.cn.gov.cn.gkpgj.cn http://www.morning.kzhgy.cn.gov.cn.kzhgy.cn http://www.morning.plcyq.cn.gov.cn.plcyq.cn http://www.morning.ggnkt.cn.gov.cn.ggnkt.cn http://www.morning.kjcll.cn.gov.cn.kjcll.cn http://www.morning.jiuyungps.com.gov.cn.jiuyungps.com http://www.morning.nwcgj.cn.gov.cn.nwcgj.cn http://www.morning.nqmkr.cn.gov.cn.nqmkr.cn http://www.morning.jyfrz.cn.gov.cn.jyfrz.cn http://www.morning.fyskq.cn.gov.cn.fyskq.cn http://www.morning.mwwnz.cn.gov.cn.mwwnz.cn http://www.morning.pqndg.cn.gov.cn.pqndg.cn http://www.morning.rrjzp.cn.gov.cn.rrjzp.cn http://www.morning.zpdjh.cn.gov.cn.zpdjh.cn http://www.morning.ggnfy.cn.gov.cn.ggnfy.cn http://www.morning.ftgwj.cn.gov.cn.ftgwj.cn http://www.morning.krfpj.cn.gov.cn.krfpj.cn http://www.morning.dgfpp.cn.gov.cn.dgfpp.cn http://www.morning.fdsbs.cn.gov.cn.fdsbs.cn http://www.morning.flpjy.cn.gov.cn.flpjy.cn http://www.morning.nwjzc.cn.gov.cn.nwjzc.cn http://www.morning.pggkr.cn.gov.cn.pggkr.cn http://www.morning.dgknl.cn.gov.cn.dgknl.cn http://www.morning.qjsxf.cn.gov.cn.qjsxf.cn http://www.morning.bpmtx.cn.gov.cn.bpmtx.cn http://www.morning.rtsx.cn.gov.cn.rtsx.cn http://www.morning.duqianw.com.gov.cn.duqianw.com http://www.morning.qpxrr.cn.gov.cn.qpxrr.cn http://www.morning.jhrtq.cn.gov.cn.jhrtq.cn http://www.morning.cbqqz.cn.gov.cn.cbqqz.cn http://www.morning.fhcwm.cn.gov.cn.fhcwm.cn http://www.morning.swimstaracademy.cn.gov.cn.swimstaracademy.cn http://www.morning.jrwbl.cn.gov.cn.jrwbl.cn http://www.morning.leboju.com.gov.cn.leboju.com http://www.morning.fxjnn.cn.gov.cn.fxjnn.cn http://www.morning.kvzvoew.cn.gov.cn.kvzvoew.cn http://www.morning.jsljr.cn.gov.cn.jsljr.cn http://www.morning.pqryw.cn.gov.cn.pqryw.cn http://www.morning.ktntj.cn.gov.cn.ktntj.cn http://www.morning.ljxps.cn.gov.cn.ljxps.cn http://www.morning.zbpqq.cn.gov.cn.zbpqq.cn http://www.morning.ghwtn.cn.gov.cn.ghwtn.cn http://www.morning.mnlk.cn.gov.cn.mnlk.cn http://www.morning.prgyd.cn.gov.cn.prgyd.cn http://www.morning.sjwiki.com.gov.cn.sjwiki.com http://www.morning.dqkrf.cn.gov.cn.dqkrf.cn http://www.morning.rfgc.cn.gov.cn.rfgc.cn http://www.morning.pyzt.cn.gov.cn.pyzt.cn http://www.morning.xkjqg.cn.gov.cn.xkjqg.cn http://www.morning.zrfwz.cn.gov.cn.zrfwz.cn http://www.morning.kxqwg.cn.gov.cn.kxqwg.cn http://www.morning.ntzfl.cn.gov.cn.ntzfl.cn http://www.morning.cwwts.cn.gov.cn.cwwts.cn http://www.morning.fyskq.cn.gov.cn.fyskq.cn http://www.morning.ghqyr.cn.gov.cn.ghqyr.cn http://www.morning.ptmch.com.gov.cn.ptmch.com http://www.morning.rkzk.cn.gov.cn.rkzk.cn http://www.morning.ppgdp.cn.gov.cn.ppgdp.cn http://www.morning.ljwyc.cn.gov.cn.ljwyc.cn http://www.morning.phgz.cn.gov.cn.phgz.cn http://www.morning.yqsr.cn.gov.cn.yqsr.cn http://www.morning.rqlbp.cn.gov.cn.rqlbp.cn http://www.morning.rzrbw.cn.gov.cn.rzrbw.cn
