上海网站建设 销售,网站上传到空间,90设计包图网,wordpress建网站详细教程做完转录组分析之后#xff0c;一般都要求做qRT-PCR来验证二代测序得到的转录本表达是否可靠。荧光定量PCR是一种相对表达定量的方法#xff0c;他的计算方法有很多#xff0c;常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法#xff0c;ΔCt法#xff0c;2^-ΔΔCt法(Livak法)一般都要求做qRT-PCR来验证二代测序得到的转录本表达是否可靠。荧光定量PCR是一种相对表达定量的方法他的计算方法有很多常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法ΔCt法2^-ΔΔCt法(Livak法)用参照基因的ΔCt法和Pfaffl法。这里主要讲解常用的2^-ΔΔCt法(Livak法)如何计算
qRT-PCR原理 以基因的cDNA为模板进行PCR扩增在PCR扩增过程中通过收集荧光信号对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系所以可以定量。
Ct值是什么意思呢 Ct 值的含义是每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 (cycle)。 qRT-PCR在扩增的时候都会有平台期在平台期之前PCR 扩增就是简单的指数增长也就是 1 变 22 变 44 变 8 …扩增。数学形式就是 2 的 ct 次方到了平台期所有基因扩增的数目是一致的而唯一有区别的则是 ct 值的不同。所以不难推断出 ct 值越小反应扩增到达平台期所需循环数越少目的基因起始含量越高。这里可以得到公式 计算-ΔΔCt
在这里我们有一个对照组一个处理组还有一个内参基因和目的基因想看一下目的基因在处理组中相对与对照中的表达差异也就是计算-ΔΔCt数据如下 1.计算每组内参基因sgAction Ct均值 2.计算第一个 Δct即每组的待检目的基因减去内参基因的 Ct 值 3.计算对照CK组中 Δct 的均值再用处理组的 每一个Δct 减去刚刚计算的对照CK组的 Δct 均值得到 ΔΔct红框框 4.相对表达量计算也就是相对于对照组: 2^-ΔΔct 不难看出这里的-ΔΔct和我们转录组当中的log2fold change值是一致的所以如果多做几个基因就可以绘制类似如下图 或者相关性点图 方法二
qPCR疑问解答
qPCR经验之谈~mp.weixin.qq.com/s?__bizMzU4MDkwMDg1NQmid2247485292idx2sn3c3b4a6bc081cad3cf9885a558a5b0ccchksmfd4e85f4ca390ce292c362a65a1b4aa96cd588c81175d31d67591f0fcbafb62d15a7ede436cbpayreadticketHLmElvoD9e7mLxIpkqmCec18xG7Dn_wCNHcnclCAdTcn6VUED2d3Nf1g8e59r3yddyk0CtA#rd编辑https://link.zhihu.com/?targethttps%3A//mp.weixin.qq.com/s%3F__biz%3DMzU4MDkwMDg1NQ%3D%3D%26mid%3D2247485292%26idx%3D2%26sn%3D3c3b4a6bc081cad3cf9885a558a5b0cc%26chksm%3Dfd4e85f4ca390ce292c362a65a1b4aa96cd588c81175d31d67591f0fcbafb62d15a7ede436cb%26payreadticket%3DHLmElvoD9e7mLxIpkqmCec18xG7Dn_wCNHcnclCAdTcn6VUED2d3Nf1g8e59r3yddyk0CtA%23rd 2–∆∆Ct 是一种计算实时荧光定量PCRqPCR时候计算样品中某个基因的相对表达量的方法。该法由Kenneth Livak和Thomas Schmittgen于2001年设计已经被广泛使用。 Ct值代表了样品的循环阈值这是在跑荧光定量PCR的时候机器反馈给你的一个数值。真正的含义是PCR过程中产物扩增出现的荧光信号达到了设定的阈值之后对应的循环数。例如 Ct 19说明这个产物扩张到第19个循环的时候才达到了设定的荧光阈值。也就可以侧面反映这个PCR时候模板的起始浓度浓度越高Ct值出现得越低。
delta意思是两个值之差 上面的公式就是用实验组的 ΔCt 减去 空白组的 ΔCt得到的 ΔΔCt 。
而 ΔCt 由以下公式得到 管家基因也就是内参基因。ΔCt是用目的基因的Ct减去内参基因得到的差值。
什么是管家基因/内参基因一般是指不受时空等其他因素影响始终能稳定高表达的一类基因。常用的有β-Actin、GAPDH、18S、UBQ、EF-1α、TIP41。
β-Actinβ-肌动蛋白GAPDH3-磷酸甘油醛脱氢酶18S18S核糖体RNAEF-1α延伸因子-1αUBQ泛素酶
如果你有一个内参基因可以参照以下案例进行计算 这是一份具有两个重复的qPCR的Ct值分别为Ct1和Ct2housekeeping gene为管家基因另一个是你需要研究的基因。
1. 平均化技术重复的Ct值。则求每个样品的Ct1和Ct2的平均值可得 2. 计算每个样品的ΔCt值。如Control 1空白对照组1的ΔCt为 所有样品的ΔCt值如下 3. 选择一个校准/参考样品用来计算ΔΔCt
用哪个样品或者样品组作为校准或参考这一步会迷惑许多人但其实取决于你的实验设置。
一般来说你可以将任意一组作为校准/参考都是可以的也就是说你用Control或Treated但是一般我们会用空白对照组为标准研究实验处理的基因表达量变化。或者如果是研究不同品种之间的基因表达量一般不用研究的那个品种作为标准。
还有一种方法就是选择用Ct值较高的一组作为参考组。
这里选择用Control组的生物学重复计算平均的ΔCt值作为参考也就是 值得注意的是如果在计算平均ΔCt的时候每个ΔCt变化较大这时候不建议用算数平均值而选择用几何平均值这样会更好处理我们的异常值。例如这里的Control组Ct值是13.38、13.60和15.80时我们选择用几何平均值 4. 计算ΔΔCt值。用每个样品所得的ΔCt减去第三步的平均ΔCt。 5. 计算 2^-(∆∆Ct)值即为每个基因的相对表达量 最后在统计分析的时候直接使用 2^-(∆∆Ct)值进行分析可能不会呈现正态分布且偏态严重这时候可以用log公式进行转化再进行后续的统计分析。即log( 2^-(∆∆Ct))。
