数据库课程设计报告网站开发,网络推广公司哪个好,网站用户注册怎么建,如何实现一个制作好的网站大家好#xff01;今天来了解一种高效的蛋白质复合物纯化和表征策略的文章——《Biofunctionalized dissolvable hydrogel microbeads enable efficient characterization of native protein complexes》发表于《Nature Communications》。蛋白质复合物在生命过程中起着关键作… 大家好今天来了解一种高效的蛋白质复合物纯化和表征策略的文章——《Biofunctionalized dissolvable hydrogel microbeads enable efficient characterization of native protein complexes》发表于《Nature Communications》。蛋白质复合物在生命过程中起着关键作用然而其分析面临诸多挑战。传统方法在纯化和表征上存在局限如低输入样本的处理以及PTMs带来的异质性问题。本文介绍的SNAP-MS方法基于生物功能化的可溶性水凝胶微珠和天然MS技术为解决这些问题提供了新途径。通过独特的工作流程和算法辅助该方法在多个应用实例中展现出高效纯化和准确表征蛋白质复合物的优势。
*本文只做阅读笔记分享* 一、研究背景与目的
蛋白质复合物在生命过程中执行着关键的生物功能对其进行分析对于理解分子水平的生物过程至关重要。然而现有的方法在蛋白质复合物的纯化和表征方面面临着诸多挑战如低输入样本的捕获和生化成分的解读以及蛋白质翻译后修饰PTMs带来的高度异质性问题。本研究旨在开发一种高效的蛋白质复合物纯化和表征策略即SNAP-MSStationary-phase-dissolvableNativeAffinityPurificationandMassSpectrometriccharacterization以解决这些问题。 二、SNAP-MS方法介绍
一SNAP-MS工作流程
1.SNAPbeads的制备
化学合成与结构SNAPbeads是基于水凝胶的微球。对于化学可溶形式的SNAPbeads合成了含有二硫键的可化学裂解的Linker1并使用N,N’-Bis(acryloyl)cystamine作为可裂解的Linker2。对于光可溶形式的SNAPbeads合成了基于o-nitrophenyl的Linker2并采用光敏感的PC-Alkyne-PEG4-NHS酯作为Linker1。 微珠形成过程通过微流体辅助乳液技术生成前驱体混合物液滴随后用APS-TEMED引发聚合反应形成特定大小的微珠。之后对诱饵蛋白和微珠进行修饰使其通过点击化学进行偶联。 例如将诱饵蛋白修饰为含有DBCO基团微珠修饰为含有叠氮基团。 2.蛋白质捕获与释放
捕获过程将生物样品与SNAPbeads孵育通过特异性的诱饵-靶标结合捕获蛋白质复合物。例如在研究中使用了多种诱饵-靶标系统如用结合了链霉亲和素SA的SNAPbeads捕获生物素修饰的绿色荧光蛋白GFP用结合了血红蛋白Hb诱饵的SNAPbeads从人血清中捕获触珠蛋白Hp等。
释放机制传统的竞争洗脱步骤被微珠基质溶解所取代。对于化学可溶的SNAPbeads在还原条件下连接子中的二硫键断裂释放出诱饵-靶标复合物对于光可溶的SNAPbeads在紫外线照射下光敏感的连接子不可逆地断裂实现复合物的释放。这一过程避免了传统方法中因竞争洗脱或连接子切割效率低而导致的问题。 3.下游分析
释放的诱饵-靶标复合物可直接用于天然MS分析或结合其他结构生物学技术如冷冻电镜cryo-EM进行进一步表征。例如在对GFP和Hp-Hb复合物的研究中都进行了天然MS分析。 二算法辅助分析
利用诱饵作为电荷去除剂和质量校正器通过串联MS的“片段互补”方法提高分析异质糖基化复合物的准确性。根据不对称电荷分配效应在串联MS过程中诱饵亚基从诱饵-靶标复合物中解离去除了多个电荷增加了电荷分辨率提高了质量/电荷测定的准确性。同时诱饵的已知质量可用于校正目标质量测定的不准确之处解决了因目标离子在不同电荷状态下质量分布不一致导致的传统算法失效的问题。
三、实验结果展示
一提高纯化效率
1.与传统珠子比较
在纯化绿色荧光蛋白GFP模型蛋白时将SNAPbeads与传统的琼脂糖珠结合了Strep-TactinST和磁珠结合了SA进行比较。结果显示磁珠由于SA和生物素之间的高亲和力结合在非变性条件下无法通过竞争洗脱释放目标GFP琼脂糖珠虽能通过竞争洗脱实现一定程度的目标回收但因大量背景蛋白的非特异性吸附导致特异性较低。而SNAPbeads表现出更高的回收率和特异性。 2.不同类型珠子比较
将SNAPbeadsType1beads与非溶解的对应物如用相同前驱体配方但不可裂解的聚合物间交联剂制成的hydrogelbeadsType2beads以及修饰了可裂解连接子的磁珠Type3beads进行比较。结果表明SNAPbeads在诱饵共轭效率、蛋白质捕获和连接子裂解等方面表现更优能够更有效地纯化目标蛋白。 二与天然MS兼容
1.复合物分析
以纯化两种在大肠杆菌中过表达的增强型GFP变体野生型EGFP和其单体型A206K突变体mEGFP为例用结合了抗GFP抗体Ab的SNAPbeads进行纯化溶解微珠并去除聚合物后通过天然MS进行分析。完整质量MS1测量揭示了目标-诱饵EGFP-Ab复合物的结合计量关系串联质量MS2测量通过碰撞解离去除诱饵可区分两种GFP变体。 2.亚基释放与分析
在蛋白质复合物的碰撞解离过程中根据诱饵和靶标的大小关系可以选择性地释放诱饵或靶标亚基。例如在EGFP-Ab复合物中由于诱饵较大目标EGFP作为高电荷密度的解离亚基被释放而当使用较小的单域抗体sdAb作为诱饵时sdAb作为高电荷密度亚基被释放目标GFP处于较低电荷状态。 三应用实例
1.蛋白质结构完整性研究
以亲和素包括天然蛋清亲和素egavidin和重组玉米表达的亲和素ravidin为例用结合了生物素的SNAPbeads进行纯化。在天然MS表征中回收的亲和素复合物在低碰撞解离设置下保留了其天然的四聚体状态未丢失任何亚基。进一步增加碰撞能量可释放亲和素单体且回收的亲和素与原始亲和素在蛋白质形式分布上高度一致证明了SNAP-MS方法能够有效保留蛋白质的四级结构和蛋白质形式分布。 2.血液样本分析
从人血清中纯化和表征触珠蛋白Hp-血红蛋白Hb复合物。不同供体的Hp在SDS-PAGE和天然MS中表现出不同的总丰度和寡聚体分布模式。通过Hb作为诱饵结合天然MS分析可以揭示Hb在Hp-Hb复合物中的占位情况以及Hp的寡聚体状态和与Hb的结合计量关系。同时利用诱饵Hb上连接子导致的质量位移可在串联MS中区分诱饵Hb和血浆Hb。 3.筛选表达和纯化策略
以热原体嗜酸菌20S蛋白酶体为例利用SNAP-MS方法筛选不同表达策略下的蛋白酶体。当α和β亚基从不同质粒表达时纯化的20S颗粒表现出异质的组成容易发生降解而当两个亚基在同一质粒中表达时可得到更稳定的完整20S蛋白酶体。通过SNAP-MS筛选后对含完整20S最多的样品进行冷冻电镜分析得到了分辨率为3.16Å的3D结构。 四、研究结论
SNAP-MS工作流程通过溶解微珠基质的方案显著提高了从生物样品中纯化蛋白质复合物的效率并提高了使用天然MS进行结构表征的可行性和准确性。
SNAPbeads与多种诱饵兼容适用于从细胞裂解物和血液样本中纯化蛋白质复合物。
天然MS提供了纯化蛋白质的多层次结构信息可用于筛选最佳表达和制备条件并辅助冷冻电镜等传统工具进行结构表征。
诱饵释放操作能够解决高度异质蛋白质系统的质谱分析问题为研究天然蛋白质复合物提供了一种通用策略。 五、一起来做做题吧
1、蛋白质复合物分析在分子水平理解生物过程中至关重要以下哪种技术在分析蛋白质复合物时不需要补充技术克服其局限性
A.核磁共振NMR光谱
B.X-射线晶体学
C.天然质谱nativeMS
D.电子显微镜EM
2、SNAP-MS方法中SNAPbeads的化学可溶形式的Linker1是通过什么方式实现裂解的
A.紫外线照射
B.化学处理还原条件
C.高温加热
D.酶解作用
3、在蛋白质捕获过程中以下哪种不是文中提到的诱饵-靶标结合的例子
A.链霉亲和素SA-生物素修饰的绿色荧光蛋白GFP
B.血红蛋白Hb-触珠蛋白Hp
C.抗体Ab-胰岛素
D.Strep-TactinST-生物素修饰的目标蛋白
4、在纯化绿色荧光蛋白GFP时哪种珠子因高亲和力结合无法通过竞争洗脱释放目标
A.结合了Strep-TactinST的琼脂糖珠
B.结合了链霉亲和素SA的SNAPbeads
C.结合了链霉亲和素SA的磁珠
D.非溶解的hydrogelbeads
5、在对亲和素的纯化和表征中回收的亲和素复合物在什么条件下保留了其天然的四聚体状态
A.高碰撞解离设置
B.低碰撞解离设置
C.特定的化学处理条件
D.特定的温度条件 参考文献
Shao X, et al. Biofunctionalized dissolvable hydrogel microbeads enable efficient characterization of native protein complexes. Nat Commun. 2024 Oct 5;15(1):8633.
